Urolithin A modulates myogenic differentiation, mitochondrial functional adaptation, and mTOR signaling during C2C12 differentiation

Abstract

Antecedentes: La diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente demandante de energía que requiere la regulación coordinada de la señalización anabólica, la síntesis proteica y la adaptación mitocondrial. En las etapas finales de este proceso (miogénesis tardía), los miotubos recién formados experimentan una maduración estructural y una remodelación oxidativa para sostener el aumento de las demandas contráctiles y metabólicas. Por ello, los compuestos que potencian la función mitocondrial podrían desempeñar un papel clave en la optimización de este proceso. La urolitina A, un metabolito de los elagitaninos derivado de la microbiota intestinal, ha demostrado mejorar la función mitocondrial y el rendimiento muscular en otros contextos experimentales y clínicos, lo que sugiere que podría influir en el acoplamiento entre la señalización anabólica y la adaptación mitocondrial. Sin embargo, su papel específico durante la diferenciación tardía permanece insuficientemente definido. Objetivo: Evaluar los efectos de la urolitina A sobre la diferenciación miogénica mediante la cuantificación de la adaptación funcional mitocondrial, la señalización de mTOR y la síntesis proteica durante la diferenciación tardía de células C2C12. Métodos: Mioblastos C2C12 fueron diferenciados y tratados con urolitina A (2 μM) desde el día 3 hasta el día 6. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayo MTT. Marcadores miogénicos como MyoD, miogenina, MRF4 y cadena pesada de miosina (MHC) se analizaron por western blot. Proteínas relacionadas con mTOR (mTOR, AKT, 4E-BP1 y p70S6K), marcadores de biogénesis mitocondrial (PGC-1a y TOM20), marcadores de dinámica mitocondrial (MFN2 y OPA1) y complejos OXPHOS (I-V) se cuantificaron por western blot. La síntesis proteica se midió mediante incorporación de puromicina (ensayo SUnSET), el índice de fusión se determinó por tinción de hematoxilina-eosina (H&E) y la capacidad respiratoria mitocondrial se evaluó por respirometría de alta resolución. La ultraestructura mitocondrial se examinó por microscopía electrónica de transmisión, y los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas no paramétricas y ANOVA de dos vías, según correspondiera.Resultados: La urolitina A (2 μM), no citotóxica, aumentó los niveles de marcadores miogénicos, incluidos MyoD y MHC, lo que sugiere una mayor diferenciación. Aunque el índice de fusión no se modificó, la urolitina A incrementó los niveles totales de mTOR, de mTOR fosforilado y de p70S6K total, a la vez que redujo las razones de fosforilación, lo que sugiere una remodelación de la vía de mTOR con regulación por retroalimentación. De forma consistente con estos cambios, la urolitina A aumentó la tasa de síntesis proteica en el ensayo SUnSET. En paralelo, la urolitina A incrementó la fosforilación de AMPKa, la expresión de PGC-1a, la abundancia de los complejos I y II de la OXPHOS y la capacidad respiratoria máxima. Los marcadores de mitofagia/autofagia y la ultraestructura mitocondrial se mantuvieron prácticamente sin cambios en estas condiciones.Conclusión: La urolitina A modula la diferenciación tardía de las células C2C12 y se asocia con alteraciones en los marcadores miogénicos, la señalización de mTOR, la síntesis proteica y la capacidad respiratoria mitocondrial, sin cambios claros en los marcadores de mitofagia/autofagia ni en la morfología mitocondrial. Estos resultados sugieren que la urolitina A podría favorecer la maduración de los miotubos al influir de manera conjunta en las adaptaciones anabólicas y mitocondriales.